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Western Blot内参抗体如何选择?

内参是由管家基因编码表达的蛋白,它们在各组织和细胞中表达相对恒定。主要用来校正蛋白质定量、上样过程中存在的误差,从而保证实验结果的准确性。也可以作为空白对照,检测蛋白转膜情况是否完、整个蛋白免疫印迹显色发光体系是否正常。内参抗体种类很多,常见的内参抗体包括β-actin、β-tubulin、GAPDH等,那么我们该如何选择合适的内参抗体呢?

 

样本种属来源:

      哺乳动物的组织或者细胞样本通常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH、HistoneH3等

      植物样本则可以选择actinRubisco

      研究者也需要参照文献报导,选择合适的蛋白作为内参

目的蛋白表达部位:

      全细胞蛋白检测一般用GAPDH、β-actin、β-tubulin等抗体作为内参而针对于核蛋白的定量,特别是样本蛋白就是核蛋白时,选择恰当的核蛋白内参则更能体现内部参照的价值。常用的核内参抗体有Lamin A、Lamin B、Histone H3除此之外,其它常见的核蛋白内参还有PCNA、K70、K80等在一些文献报道中,ERK2、TATA binding protein (TBP) 以及c-Jun、c-Fos等都有使用。而对于膜蛋白检测,常用的内参抗体为Na+ /K+-ATPase

      对于一些植物的样本,则需要特别的植物Actin蛋白作为内参。当实验样品中只是核蛋白,而不是细胞总蛋白提取液时,可以用组蛋白H(Histone H),或者增殖细胞核抗原(PCNA)等为核内参抗体。对于线粒体蛋白的检测,常用COX IV或VDAC1作为内参抗体,这里面COX IV又是被引用最多的线粒体内参。对于叶绿体蛋白的检测,常用Rubisco作为内参。

目的蛋白大小:

选择内参抗体时应考虑目的蛋白分子量大小,通常保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5kDA以上

蛋白表达要恒稳

挑选的内参是否会受实验变化影响。例如,GAPDH是常用的内参,但在缺氧和糖尿病等疾病存在下,会增加GAPDH在特定细胞和组织中的表达,在代谢糖酵解的研究中就不适合作为内参。


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